지지플랏의 DataScience

2010-1

화학생명공학실험1 (예비)

실험주차 : 4주차

실험제목 : 유전자 조작실험 3, 재조합 plasmid를 이용한 형질 전환 및 재조합 대장균 선별

제출날짜 : 2010년월일

담당교수 : 김상욱 교수님

학번 : 200920344

이름 : 임 정

1. 실험목적 : 특정 유전자가 삽입되어 있는 plasmid DNA를 숙주세포인 competent cell (E. coli XL1-blue)에 도입시키고 재조합 된 DNA를 보유하고 있는 숙주세포를 선별하는 방법을 배운다. transformation시 사용하는 방법은 electroporation method이다.
2. 실험원리
3. Transformation 2가지 방법(장단점)
4. Calcium phosphate 를 이용한 방법 :

화학처리에 쓰이는 시약에는 (CaCl2 /heat shock method) 외에도 MgCl2, Hexamminecobalt chloride, Dimethl Sulfoxide (DMSO) 등 여러 가지가 있다. 이중 가장 중요한 것이 CaCl2이다. 설명하기에 앞서 competent cell에 대해 설명하면 유전자복제에 필수요소로써 E.coli (e.g. DH1, DH2, 그리고 MM294) 를 포함한 대부분의 박테리아 종들을 효율적으로 transform하기 위해서, 박테리아는 물리적 또는 화학적 처리를 통해 DNA 획득 능력을 증가시킬 수 있다. 이렇게 처리된 세포들을 `competent cell` 이라고 부른다. 이러한 Competent cell에 DNA를 첨가 시키면 세포질에 들어가지 못하고 세포벽에 남아있게 되는데 온도가 42℃로 올라가게 되면 비로소 DNA는 competent cell 안으로 들어가게 된다. 따라서 CaCl2로 처리하여 competent cell로 만들면 plasmid가 cell에 들어갈 수 있게 되고 Heat shock을 가하면 plasmid 가 cell 안으로 들어가는 효율을 증가시키는 것이다. 이러한 E. coil의 형질전환은 초기에는 발견이 되지 않았으나 bacteria를 차가운 CaCl2로 처리한 다음 잠시 열처리를 하면 bacteriophage λ가 세포 내로 들어가 phage를 형성한다는 사실에 의해 처음 관찰되었다. 이와 같은 처리는 bacteria의 세포막이 DNA가 infection될 수 있는 competent 상태로 일시적으로 유도되는 것으로 이때의 bacteria를 protoplast라고 한다. Calcium phosphate의 침전물을 세포가 효율적으로 받아들인다는 발견은 실험적 관찰을 기초로 알게 되었다. 사실, bacteria에서 2가 양이온인 calcium이나 magnesium등에 의해 DNA의 삽입이 잘 이루어진다는 것은 이미 알고 있었으며, 이러한 사실을 이용하여 2가 양이온인 calcium에 DNA를 흡착시키고 calcium phosphate의 침전물을 생성하여 세포가 이를 받아들이도록 유도하는 방법을 고안하였다.

1. - Liposome을 이용한 방법 :

DNA를 비롯한 많은 약물들이 그 자체(free form)만으로는 체내에 투여해도 표적세포 내로 들어가지 못하는 것들이 많다. 리포솜은 이러한 약물이나 DNA를 내부에 함유(encapsulation) 시키거나 정전기적으로 결합(binding)된 형태로 세포막을 통과하여 세포 내로 약물을 전달할 수 있다. 리포솜은 지질 이중막으로 구성된 구형 또는 타원형의 다양한 모양과 크기를 갖는 주머니 형태로 존재하고 있어 리포솜 내부의 액상공간에 각종 약물을 탐지하여 전달할 수 있다. 또한 리포솜 외벽에는 목적하는 바에 따라 화학적 변형 이 가능하고 이를 이용하여 각종 생리활성 물질(Bioactive material)을 결합시켜 약물전달에 활용할 수 있게 되는 것이다. 기본적으로 약물 등을 세포 속으로 효율적으로 전달하는 기능 외에도 보호 기능(Protection), 약물독성 감소와 가용화, 세포내 전달(Intracellular Delivery), 표적화(Targeting)할 수 있는 능력이 있다.

1. Recombinant DNA들어 간 것 선별방법

벡터를 제한효소로 자르고 같은 제한효소로 자른 특정 생물의 DNA절편을 붙일 때, 몇가지 형태의 분자가 나온다. 이들은 다음과 같다.

1. 어떠 외부 DNA도 함유하지 않는 재결합한 벡터
2. 하나 또는 하나 이상의 외부 DNA절편을 가진 벡터
3. 벡터없이 생물의 DNA만 연결된 형태. 이러한 분자는 복제원점이 없어 박테리아 내에서 복제될 수 없다.

특정 유전자를 가진 벡터를 함유한 세균 콜로니의 분리를 손쉽게 하는 방법은 첫 번째, 군체를 박테리아가 벡터를 함유했는가를 확인하고, 두번째, 그벡터는 삽입된 외부 DNA절편을 가지고 있는가, 세 번째, 그 절편이 관심이 대상이되는 DNA절편인가를 확인하는 것이다. 이 절에서 재조합 벡터를 탐색하는 몇가지 유용한 방법을 설명 할 것이다.

만약 특별한 DNA조각이나 유전자를 클로닝 하려면, 그부분을 가진 벡터를 외부 DNA를 함유한 모든 벡터로부터 분리해야만 한다. 많은 유전자의 경우 단순한 선별 기술로 그 유전자를 가지고 있는 벡터를 회수할 수 있다. 예를 들어, 클로닝할 유전자가 세균의 루신 유전자라면, 루신을 합성할 수 없는 세균 숙주(Leu-)를 이용하여 루신이 없는 배지에서 자라는 Leu+군체를 선별하면 된다. 이러한 방법은 중간대사 산물을 암호화하는 세균 유전자를 클로닝 하는데 유용하다. 그러나, 종종 클로닝 하고자 하는 유전자는 세균 숙주의 표현형을 변화시키지 않는 산물을 암호화하는 진핵생물의 유전자이다.

일반적으로 표현형을 쉽게 구별할 수 없는 재조합 클론은 콜로니내에 있는 DNA가 외부유전자를 탐지를 위해 방사선 동위원소가 표지된 탐침과 혼성화반응을 하는가에 따라 동정된다. 세균 콜로니는 보통 니트로 셀룰로스나 나일론 필터와 같은 고체지지물에 복사판으로 만들어진다. 복사판 위의 세균은 알칼리 처리에 의해 분해되고, 그들의 DNA는 변성되고, 중화시켜 32P-로 표지된 탐침가 혼성화 반응이 일어나도록 한다. 그때 32P-표지된 탐침의 위치는 필터에 X-레이 필름을 노출시켜 알아낸다. 탐침의 DNA와 혼성화반응을 한 DNA를 방출한 세균 군체는 원래의 세균배지와 X-레이 필름을 정렬하여 찾아낸다. 이 방법으로, 수백개의 군체를 동시에 선별하고 재조합 플라스미드를 운반하는 군체를 인지하는 것이 가능하다. 이 방법은 콜로니 혼성화 반응이라 부른다.

1. 참고문헌

분자생물학, George M. Malacinski 저, 심웅섭 외 7명 역, p 364~365

2010-1

화학생명공학실험1 (결과)

실험주차 : 3주차

실험제목 : 유전자 조작실험2, ligation 통한 재조합 plasmid 제조

실험날짜 : 2010년 5월19일

제출날짜 : 2010년 5월 26일

담당교수 :

학번 :

이름 :

1. 실험 목적 : 유전공학에서 사용되는 기초실험인 재조합 DNA복제의 제조방법을 이해한다. 제한효소가 처리된 DNA에 ligase를 처리하여 통하여 최종적으로 DNA 분자를 제조한다.

1. 실험 방법 및 재료

1)재료

※ : Vector 양 = insert 양 (단위 : ng)

( Insert size : 0.25 kb vector size : 4.5kb )

2) 실험 방법

(1) 지난 실험에서 추출되었던 Vector Plasmid, Insert 를 buffer와 분리시킨다.

(2) Ligase와 그에 필요한 buffer을 준비하고 vector와 insert DNA를 얼음 위에 녹여둔다.

(3) 다시 ligase효소를 넣어 재조합 하기 전에 알맞은 ligase의 양과 그에 상응하는 buffer의 양 vector와 insert양을 최적의 비율로 반응할 수 있게 계산한다.

(4) 파이펫으로 해당 물질을 적정한다.

(5) 4 ℃ 에서 5 pm~ 9 am 동안 효소 반응을 시켜준다.

(6) 전기 영동으로 DNA의 ligase유무를 확인한다.

(7) 필요에따라 Ethanol 침전법이나 DNA purification kit 를 이용하여 DNA 만을 회수한다.

1. 고찰

이번 실험은 목적에서 보다시피 저번 실험에서 제한효소로 잘랐던 DNA를 다시 ligase효소를 이용하여 다시 DNA를 재조합 하는 과정이다. 기본적으로 지난 시간에 결과로 나왔던 plasmid를 이용하여 했기 때문에 조마다 약간 씩 적정해야하는 성분의 양이 달랐다. 우리는 기본적으로 10 µl을 총량으로 하여 계산하였다. Vector를 200ng 을 기준으로 잡고 insert size와 vector size와 관계를 비교해서 적정한 insert 양을 구하는 계산은 molar ratio로 vector : insert= 1:3 ~ 1:10(sticky end ) 또는 1:5 ~ 1:20(blunt end) 였다. Sticky end가 서로 결합을 잘 하고 있는 이유에서 이런 비율의 차이가 난다. 그 결과 33.3 ng 의 insert 가 필요하다는 것을 알았다. 그러기 위해서 1. 67 µl 의 insert을 적정해야 했다. ligase효소를 넣고 그 효소가 최적활성을 가질 수 있는 환경을 꾸며줄 buffer역시 10%비율로 1 µl 을 첨가 하게되었다. 이대로 계산하면 5.67 µl 가 나오는데 우리가 쓴 ligase 는 400 unit / µl 단위로 회사에서 권장하는 양은 400 unit, 그리고 total volume 10 µl 에 비해 부족한 수치였다. 나머지를 UPW로 채울 수 도 있지만 기본적으로 각 성분의 용매로 물이 쓰이므로 DNA의 양을 각각 2배씩 늘리기로 했고 vector는 4 µl, insert 4 µl 를 넣기로 했다. Insert가 기존의 들어갈 양의 2배가 약간 넘는 것은 총 10 µl를 채워주기 위함이 였으며 기본적으로 vector가 정해져 있으므로 insert의 양이 더 많아도 최종 재조합 되는 DNA의 양은 동일하다고 생각되어 시행했다. 또한 실험이 지남에 따라 DNA와 buffer와 다른 물질을 분리하는데 있어서 DNA의 농도가 낮아지는 것은 어쩔 수 없는 현상이므로 부족하지 않게끔 넣은 의미도 있었다. 적정을 다한 후에 반응하는 법은 상온에서 4시간, 4 ℃ 에서 overnight(PM 5 ~ AM 9), 15 ℃에서 4~15hr 의 3가지 방법이 있는데 시간이 낮을수록 오랜 시간 반응을 시킴을 알 수 있다. 우리는 4 ℃에서 일주일간 반응 시킬 것이고 시간이 다소 길지만 결과적으로 vector와 insert 재조합은 반응이 될 것들만 되고 안되는 것은 끝까지 되지 않기 때문이다.

1. 참고문헌

분자생물학, George M. Malacinski 저, 심웅섭 외 7명 역,p 349~353