생명공학실험 2주차 예비

2010-1

화학생명공학실험1 (예비)

실험주차 : 2주차

실험제목 : 유전자 조작실험 1, DNA 제한효소 처리

제출날짜 :2010년5월12일

담당교수 :

학번 :

이름 :

1. 실험목적 : 유전공학에서 사용되는 기초실험인 재조합 DNA분자의 제조방법을 이해한다. 그 첫 단계로 재조합 DNA분자를 제조하기 위해 DNA의 농도를 측정하고 제한효소를 이용하여 절단한다.

2. 실험원리

(1) 제한효소란

대부분의 세균에서 발견된 제한효소는 외래 생물체의 DNA를 인식하고 분해한다. 세균은 수백만년동안 외래 DNA의 침입에 직면해 왔으며, 침투한 DNA를 파괴하는 동안 자신의 DNA를 보존하는 보호 메커니즘으로써 이들 효소들을 발전시켜왔다. 각 제한 효소는 일반적으로 4~6염기쌍 정도의 짧은 염기서열만을 인식한다. 예를 들어 최초로 분리된 제한효소중 하나인 EcoR1(Escherichia coli로부터 분리 됨)은 오직 오른쪽 염기서열을 가진 DNA만을 절단한다.

이 경우 표적 염기서열은 앞쪽과 뒤쪽으로 똑같이 읽혀지기 때문에 팔린드롬 구조( 또는 회문성 구조) (palindrome)라 부른다. 간단히 언급하면 많은 제한효소 (모두를 의미하지않음) 는 회문성 구조의 표적서열을 인식한다. 만일 이 서열이 침입한 원형의 플라스미드에 하나 존재한다면 효소는 그곳을 한번 절단하여 원형을 푼다. 만약 이 서열이 여러부위에 있다면 DNA는 여러 조각으로 절단되게 된다. 일반적으로 제한효소의 명칭은 출처 박테리아의 속명 첫 자와 종명의 처음 두 문자로 나타낸다. (예를 들면 EcoR 1은 Escherichia coli에서 분리되었고 HindⅢ는 Hemophilus influenzae, Taq1은 Thermus aquatius로부터 분리되었다.)

Type Ⅰ : 제한효소와 메틸화효소가 뭉쳐져 있고, 인식자리와 제한자리가 서로 다르다. 염기서열은 특이적으로 인식하지만, 인식자리에서 약 1000개 염기 정도 떨어진 곳에서 비특이적으로 DNA를 자른다. 또한 활성에 ATP나 AdoMet, Mg2+를 필요로 한다. 따라서 실제 실험에서는 거의 사용하지 않는다.

Type Ⅱ : 인식자리가 특이적이고 제한자리 또한 주변의 염기로 특이적으로 작용한다. 실험실에서 주로 사용하는 것이 이 Ⅱ형이다.

Type Ⅲ : Ⅰ형과 마찬가지로, 제한효소와 메틸화효소가 합쳐져 있다. 효소 활성에 ATP가 꼭 필요하고, 완전 절단이 거의 일어나지 않는 특징이 있다. DNA를 자르기 위해서는 DNA 분자 반대 방향으로 놓여 있는 또 다른 인식 염기서열이 있어야 한다. ex) EcoPⅠ, HintⅢ, StyLTⅠ

(2) star activity란 , 줄일 수 있는 방법

Star activity는 효소가 그들이 최적 환경과 다른 조건 안에서 DNA를 자르는 제한효소의 특이성이 변질되고 약화되는 것이다. 결과는 전형적으로 목표부위를 자르지 않게 되거나 때때로 특이성을 완전히 상실해 버린다. star activity를 일으키는 차이점은 낮은 ionic strength, 높은 pH, 그리고 높은 글리세롤 농도가 있다. 후자의 조건에 관심을 가질 수 있는 것은 공업 제한효소들은 보통 상당한 양의 글리세롤을 포함하는 buffer에서 공급되기 때문에 그것은 의미는 불충분한 효소의 희석용액은 star activity를 야기 시킬 수 있다는 것이다. 이를 줄이기 위해서는 제한 효소가 활동할 수 있는 적절한 환경을 갖춰 주면 에러를 줄일 수 있다.

(3) sticky end/blunt end

sticky end : Non-blunt end는 다양한 overhangs에서 만들어진다. overhangs는 DNA분자들의 끝에서 짝짓지 않은 nucleotide들의 뻗침이다. 이 nucleotide들은 3‘ 또는 5’ overhangs를 형성할 수 있는 가닥이 될 수 있다. 이 ovehangs는 대부분 팔린드롬 구조( 또는 회문성 구조 [palindrome])에 있다. overhangs의 가장 간단한 구조는 단일 nucleotide이다. 이것은 가장 아데노신이 많고 몇의 DNA polymerase로 의해 3‘ overhang로써 만들어졌다. 흔히 이것은 그러한 효소들에 의해서 만들어진 PCR 생성물을 복제하는 것에 쓰인다. 생성물은 3’티민 overhangs가 있는 직선 DNA 분자와 결합을 한다. 아데닌과 티민이 염기 쌍을 형성하기 때문에 이것은 원형 분자를 만들어 내면서 리가아제(ligase)에 의해 두 분자 결합이 촉진된다. 더 긴 overhangs들은 sticky ends 또는 cohensive

ends 라고 불린다. 그것들은 대부분 제한 엔도 뉴클라제(restriction endonucleases)가 DNA를 자를 때 만들어진다. 매우 흔하게 nuclease는 두 DNA 가닥을 각각 4개의 염기 쌍으로 자른다. 이 끝이 리가아제에 의해 쉽게 다시 붙기 때문에 cohensive(응집력있는), sticky(끈끈한)라고 부른다.

blunt end : 이중가닥 분자의 가장 간단한 DNA 말단은 blunt 말단이라 불린다. Blunt 말단인 분자에서 양쪽 가닥은 염기쌍을 없애버린다. 밑의 그림과 같이 제한효소가 작용한다. blunt 말단은 자발적으로 원형화 될 수 없다. 또한 DNA 리가아제를 쓰면 두 분자가 하나로 합쳐져서 blunt 말단이 매우 적게 존재하기 때문에 Blunt 말단들은 항상 존재하는 것은 아니다.

(4) unit(enzyme 단위)

효소 단위는 특정한 효소의 양에 대한 단위이다.

1 U는 단위 분 동안 1 μmol의 기질을 촉진시키는 효소의 양으로 정의한다. 조건 또한 명명확하게 되어야한다 : 25℃, 가장 많은 기질이 생성될 수 있는 pH 값과 기질 농도

3. 참고문헌

분자생물학,4판,George M. Malacinski 저, 심웅섭 외 7 역 p350~352

http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_unit

http://en.wikipedia.org/wiki/Star_activity

http://en.wikipedia.org/wiki/Sticky_end#Overhangs_and_sticky_ends

http://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%A0%9C%ED%95%9C%ED%9A%A8%EC%86%8C