생명공학실험 1주차 결과

2010-1

화학생명공학실험1 (결과)

실험주차 :1 주차

실험제목 :PCR을 이용한 유전자 증폭

실험날짜 :2010년5월8일

제출날짜 :2010년5월11일

담당교수 :

학번 :

1. 실험목적 : Polymerase Chain Reaction 을 이용하여 DNA에서 원하는 부분만을 증폭하고 그 원리를 이해한다.

2. 실험 방법 및 재료

실험방법

(1) 10× Taq polymerase PCR buffer와 dNTP(10mM) , Primer (10 pmol/㎕)를 미리 얼음 위에서 녹인다.

(2) 증폭하고자 하는 target 유전자를 포함한 DNA를 준비한다.

(3) 멸균된 PCR tube에 준비된 재료들을 넣고 섞어 반응액을 만든다.

(4) 준비된 반응액에 Taq polymerase를 첨가한다.

(5) Thermo cycler의 program을 setting 하고, PCR 반응을 시작한다.

(6) PCR반응이 완료되면 전기영동을 실시하여 PCR product band를 확인한다.

(7) PCR product purification kit 또는 agarose gel elution kit를 이용하여 정제한다

시약

	준비시약	PCR 이용	실제	넣는 순서
UPW		·	38.6 ㎕	1
buffer	10X	Tris-HC PH 8.81(25℃)20㎖ 2mM HCl 10mM ....등	5㎕	2
dNTP	10mM	0.2mM	1㎕	3
primer	forward(10pmol/㎕) backward(10pmol/㎕)	0.4 μM	4μl (각 2μl씩)	4
template	10ng/㎕	1ng	0.4㎕	5
pfu polymerase	2.5 Unit/㎕	1~2 Unit	1㎕	6
총합	50㎕

UPW : Ultra Pure Water로 이온이 매우 적은 순수한 물이다.

buffer : 중합효소가 활성을 가기위해 최적의 이온 농도나 PH값을 갖게 하는 것으로 HCl, 등이 있다. 효소를 구입하게 되면 그에 맞는 buffer가 같이 오게 된다 .

dNTP : DNA가 중합되는데 재료가 되는 4가지의 염기를 말한다.

primer : polymerase는 중합 개시부분을 인식하지 못하여 primer가 주형 DNA의 template에 접하여 중합을 시작하게 한다.

template : 중합하는데 기준이 되는 DNA로써 polymease가 상보적 염기를 따라 합성하게 되는 가닥이다.

pfu polymerase : Taq polymerase는 없는 교정기능을 가지고 있기 때문에 속도는 약간느리지만 에러율이 급격히 낮아진다. 3'->5' 방향의 exonuclease를 가지고 있으며 90℃에서 200분 이상까지 버틸 수 있다.

3. 실험결과

실험결과 우리가 넣어준 DNA는 1500 bps였고 전기영동을 한 결과 역시 1500bps에 band를 나타 내었다. 이것은 중합된 DNA들이 모두 1500bps 의 길이에 밀접한다는 것을 뜻하며 실험이 성공적이라고 할 수 있겠다.

4. 고찰

(1) Predenaturation : 94℃에서 3분간 진행한다. denaturation,은 DNA에 열을 가해서 DNA를 변성시키는 과정이다. DNA을 중합하기에 앞서 각 염기들은 상봊거으로 수소 결합을 하고 있기 때문에 double strand DNA을 single strand 로 만들어 공간을 확보할 필요가 있다.체내에서의 DNA과정에서는 Helicase라는 DNA의 꼬임을 풀어주는 효소가 있지만 그 역할을 대신하기위해서 온도를 가해 수소결합을 끊어 사이에 효소가 작용하면서 중합하게 된다. 이런 과정을 DNA의 변성이라고 하며 이 가닥이 풀어지는 때의 온도를 Tm이라고 한다. Tm은 Adenine(A)과 Tymine(T)이 이중결합을 하는 반면 Guanine(G) 과 Cytocine(C)이 삼중결합을 하기 때문에 GC의 함유랑이 많을 수록 Tm 값이 높아진다. 따라서 Tm값은 대략 4*(G,C)+2*(A,T)에 비례한다.

(2) DNA denaturation : 94℃에서 30초간 진행한다. 위 과정과 비슷하다.

(3) Primer Annealing : target template에 primer가 결합하는 과정으로 56℃에서 30초간 진행한다. 물론 이때 56℃는 Tm보다 크다.

(4) Extension : primer가 template에 결합한 후 상보적 염기 서열을 따라 nucleotide를 합성하는 과정으로 72℃에서 30sec동안 진행된다.

(5) 2번부터 4번 과정을 1주기로 25 cycle을 돌게된다.

(6) End filling(final extention) : 주형 DNA의 3'쪽의 충분한 Extension을 위해 72℃에서 7분간 실시한다.

(7) 4℃에 보관한다.

(8) 전기영동으로 실험 결과를 관찰하게 된다

.

＊전기 영동이란 길이가 각기 다른 DNA를 agarose gel 이나 polyacrylamide gel 상에서 전하를 걸어 이동시키는 방법이다. 짧고 가벼운 DNA일 수록 망상조직을 쉽게 통과해 더 밑으로 갈 수 있고 큰 DNA일수록 조직에 걸려서 밑으로 조금밖에 이동을 하지 못할 것이다. 원리에 따라 위 결과처럼 밑으로 갈수록 천단위 bp에서 점점 백단위 bp 로 줄어드는 것을 볼 수 있다.

시약을 준비하는데 있어서 시약은 우리가 원하는 만큼만 있는 것이 아니라 준비 시약과 실험에 필요한 시약의 양은 다르다. 따라서 준비시약의 농도에 따라 우리가 취하고자 하는 mol 또는 부피 만큼 간단한 계산을 하였다. 이론을 정립한 후 실험을 실행한다. 위 실험방법에서 보듯이 시약이 우리가 필요한 만큼 주어지는 것이 아니라 파이펫을 이용해 ㎕단위로 따야 한다. 파이펫을 사용함에 있어서 주의를 할 것은 작은 단위의 부피를 취하고자 한다면 큰 단위의 파이펫보다 보다 근접하고 작은 단위의 파이펫을 사용하도록 하자. 오차를 줄이려는 노력이다. 또한 파이펫으로 취하고 tube에 옮겨 넣을 때 살짝 걸릴 때 까지 누르면 취한 액체가 나가고 한번 더 누르면 남아 있는 방울까지 모두 tube안에 넣을 수 있다. 단위가 매우 작기 때문에 남아있는 한방울도 오차가 크게 발생할 수 있기 때문에 유의한다. 파이펫을 다 사용한 뒤 눈금을 원점으로 맞춰 놓도록 한다. 영점조정을 하지 않으면 용수철이 늘어나거나 줄어든 채로 고정되어 후에 파이펫의 오차를 늘일 수가 있다. 해당 시약을 넣을 때도 부피가 큰 순서대로 넣는 것이 좋고 polymerase가 먼저 들어가면 꼬일 수가 있기 때문에 맨 나중으로 배치하는 것이 옳다.

필요한 조건들을 만족시키고 전기영동을 했더니 우리가 원하는 1500bps 에 집중되어있는 band가 나왔다. 실험은 아주 깔끔하게 나왔다. 만약 band가 뚜렷하지 않고 위 아래로 흩어져 있어서 흐리게 나온다면 DNA mutation을 의심할 수 있다. DNA의 1,2개의 bp가 돌연변이를 일으켜 primer가 muation한곳에 어닐링 함으로써 중합한 DNA의 bp가 다양하게 나오게 되고 그에 따라 밴드가 흐릿하게 나오는 것이다.

5. 참고문헌

분자생물학,4판,George M. Malacinski 저, 심웅섭 외 7 역 p30, p49~50, p356~357

The PCR technique : DNA sequencing/james Ellingboe, Ulf B. Gyllenstmp/ p1~6