유전자 조작실험2, ligation 통한 재조합 plasmid 제조

2010-1

 

화학생명공학실험1 (결과)

 

 

 

 

실험주차 : 3주차

실험제목 : 유전자 조작실험2, ligation 통한 재조합 plasmid 제조

 

 

 

 

 

실험날짜 : 2010년 5월19일

제출날짜 : 2010년 5월 26일

담당교수 :

학번 :

이름 :

1. 실험 목적 : 유전공학에서 사용되는 기초실험인 재조합 DNA복제의 제조방법을 이해한다. 제한효소가 처리된 DNA에 ligase를 처리하여 통하여 최종적으로 DNA 분자를 제조한다.

 

1. 실험 방법 및 재료

 

1)재료

	요구 첨가량	준비용액	이용	실제 첨가량
Vector	200 ng	100 ng/μl	2 μl	4 μl
Insert	33.3 ng ※	20 ng/μl	1.67 μl	4 μl
Buffer	1 μl	Tris HCl 660mM(PH 7.6) MgCl2 66mM DDT 10MM ATP 1mM	1 μl	1 μl
Ligase	400 unit	400 unit/ μl	1 μl	1 μl
총량				μl

 

※ : Vector 양 = insert 양 (단위 : ng)

 

( Insert size : 0.25 kb vector size : 4.5kb )

 

2) 실험 방법

(1) 지난 실험에서 추출되었던 Vector Plasmid, Insert 를 buffer와 분리시킨다.

(2) Ligase와 그에 필요한 buffer을 준비하고 vector와 insert DNA를 얼음 위에 녹여둔다.

(3) 다시 ligase효소를 넣어 재조합 하기 전에 알맞은 ligase의 양과 그에 상응하는 buffer의 양 vector와 insert양을 최적의 비율로 반응할 수 있게 계산한다.

(4) 파이펫으로 해당 물질을 적정한다.

(5) 4 ℃ 에서 5 pm~ 9 am 동안 효소 반응을 시켜준다.

(6) 전기 영동으로 DNA의 ligase유무를 확인한다.

(7) 필요에따라 Ethanol 침전법이나 DNA purification kit 를 이용하여 DNA 만을 회수한다.

 

1. 고찰

이번 실험은 목적에서 보다시피 저번 실험에서 제한효소로 잘랐던 DNA를 다시 ligase효소를 이용하여 다시 DNA를 재조합 하는 과정이다. 기본적으로 지난 시간에 결과로 나왔던 plasmid를 이용하여 했기 때문에 조마다 약간 씩 적정해야하는 성분의 양이 달랐다. 우리는 기본적으로 10 µl을 총량으로 하여 계산하였다. Vector를 200ng 을 기준으로 잡고 insert size와 vector size와 관계를 비교해서 적정한 insert 양을 구하는 계산은 molar ratio로 vector : insert= 1:3 ~ 1:10(sticky end ) 또는 1:5 ~ 1:20(blunt end) 였다. Sticky end가 서로 결합을 잘 하고 있는 이유에서 이런 비율의 차이가 난다. 그 결과 33.3 ng 의 insert 가 필요하다는 것을 알았다. 그러기 위해서 1. 67 µl 의 insert을 적정해야 했다. ligase효소를 넣고 그 효소가 최적활성을 가질 수 있는 환경을 꾸며줄 buffer역시 10%비율로 1 µl 을 첨가 하게되었다. 이대로 계산하면 5.67 µl 가 나오는데 우리가 쓴 ligase 는 400 unit / µl 단위로 회사에서 권장하는 양은 400 unit, 그리고 total volume 10 µl 에 비해 부족한 수치였다. 나머지를 UPW로 채울 수 도 있지만 기본적으로 각 성분의 용매로 물이 쓰이므로 DNA의 양을 각각 2배씩 늘리기로 했고 vector는 4 µl, insert 4 µl 를 넣기로 했다. Insert가 기존의 들어갈 양의 2배가 약간 넘는 것은 총 10 µl를 채워주기 위함이 였으며 기본적으로 vector가 정해져 있으므로 insert의 양이 더 많아도 최종 재조합 되는 DNA의 양은 동일하다고 생각되어 시행했다. 또한 실험이 지남에 따라 DNA와 buffer와 다른 물질을 분리하는데 있어서 DNA의 농도가 낮아지는 것은 어쩔 수 없는 현상이므로 부족하지 않게끔 넣은 의미도 있었다. 적정을 다한 후에 반응하는 법은 상온에서 4시간, 4 ℃ 에서 overnight(PM 5 ~ AM 9), 15 ℃에서 4~15hr 의 3가지 방법이 있는데 시간이 낮을수록 오랜 시간 반응을 시킴을 알 수 있다. 우리는 4 ℃에서 일주일간 반응 시킬 것이고 시간이 다소 길지만 결과적으로 vector와 insert 재조합은 반응이 될 것들만 되고 안되는 것은 끝까지 되지 않기 때문이다.

1. 참고문헌

분자생물학, George M. Malacinski 저, 심웅섭 외 7명 역,p 349~353