생명공학실험 1주차 예비

1. 실험 목적 : Polymerase Chain Reaction 을 이용하여 DNA에서 원하는 부분만을 증폭하고 그 원리를 이해한다.

2, 실험 원리

(1) PCR 원리

1983년 새로운 기술인 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction [PCR])이 고안되었다. 이 기술은 드물게 존재하는 DNA 서열의 탐지와 클로닝을 가능하게 한다. 방법은 게놈 DNA내 표적 DNA 서열의 증폭에 기초를 두고 있다. 이 방법은 기본적으로 큰 DNA 절편에 해당되는 작거나 중간크기의 절편을 다수 생성하는 것이다. PCR 방법의 뚜렷한 장점은 반응에 아주 소량의 시료가 필요하다는 것이다. 증폭하고자 하는 표적 DNA의 한 DNA 사슬 3‘ 말단에 상보적인 것과 그 반대 사슬의 3’ 말단에 상보적인 두 개의 특정 oligonucleotide를 합성한다. 이 oligodeoxynucleotide를 원하는 절편을 함유한 변성된, 한 가닥의 표적 DNA와 혼성화반응을 시킨다. 이 oligonucleotide는 프라이머 (또는 시발체)로 작용한다. 올리고 누클레오티드의 5‘말단은 Taq 중합효소(열에 안정성이 있는 DNA-의존 DNA중합효소로 호열성 세균인 Thermus aquaticus에서 분리됨)에 의한 주형사슬의 증폭 개시점으로 작용한다. 주형 사슬이 복제된 후 그 복제산물들은 융해에 의해 변성되며, 반응물은 합성된 산물과 주형사슬 모두에 primer가 어닐링 annealing)되도록 어닐링 온도를 낮추고, 또 다른 복제 과정을 시작한다. 10분 이내가 소요되는 이 과정은 원하는 만큼 반보갈 수 있다. 첫 번째 몇 번의 과정 후 대부분 증폭산물은 주형 DNA 3’부위 사이의 절편이 증폭된 것이다. 이 후 주형 DNA 연장은 무시 할 정도로 희석된다. Taq 중합효소는 각 라운드 후 사슬을 분리하기 위한 가열 단계에서도 불활성되지 않는 성질을 갖고 있기 때문에 이용된다. 중합효소 연쇄반응은 온도 순환과정을 자동으로 프로그램화 할 수 있는 기계를 이용해 수행한다.

(2) Polymerase 종류 및 특성

DNA Polymerase I : 진핵생물에서의 DNA 복제 과정에 참여하는 효소이다.

DNA Polymerase Ⅱ : 진행생물의 손상된 DNA 복구에 관여한다.

DNA Polymerase Ⅲ : 박테리아의 주요 중합효소이다(DNA 복제 신장)

그 외 에도 DNA Polymerase Ⅳ, Ⅴ 등 이 있다.

Taq Polymerase : 내열성의 DNA 중합효소로 DNA의 작은 절편을 크게 확장 시키는 방법으로 PCR에 많이 쓰인다.

Pfu Polymerase : hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus에서 발견되는 효소로 생물체 안에서 유기체의 DNA를 복제하는 기능을 한다. Pfu는 PCR에서 DNA를 확장하는데 이용되곤 한다.

(3) PCR 각 step 마다 원리/이유(시간, 온도 등)

• DNA 의 변성(denaturation)

90℃ ~ 96℃로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 sing strand DNA(ss DNA)로 분리 시킨다. 높은 온도 일수록 ssDNA가 잘 이행 되지만 taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성이 낮아 질수 있으므로 보통 94℃로 한다. 첫 cylce 에서는 확실한 quss성을 위하여 약 5분간 지속시키도록 한다.

• Primer 의 결합 (annealing)

50℃ ~ 65℃에서 진행한다. 염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 겨합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것이 좋다. 사실 primer 를 만드는 것도 이 annealing temperature를 고려하여 합성해야 하는데, 일반적으로 GC content가 50%가 되는 primer 쌍을 이용한 것이 바람직하다. 약 30초~1분정도 지속한다.

• DNA의 합성(Polymerization)

70℃~ 74℃에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000~4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1kb마다 1분의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히(10분) 주어 효소의 활성이 충분히 바휘 되도록 한다.

(4) Primer 역할

Primer란 PCR에서 증폭시킬 위치에 보합하여 DNA복제를 유도하는 짧은 인조DNA를 칭한다.

3. 참고 문헌

분자생물학,4판,George M. Malacinski 저, 심웅섭 외 7 역 p49~50, p356~357

http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase - Polymerase

http://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%A4%91%ED%95%A9_%ED%9A%A8%EC%86%8C_%EC%97%B0%EC%87%84_%EB%B0%98%EC%9D%91 - 중합효소

http://en.wikipedia.org/wiki/Pfu - Pfu polymerase

http://en.wikipedia.org/wiki/Taq_polymerase - Taq polymerase